Kit se composant de :
Gram Crystal Violet Pour la coloration différentielle des bactéries : 1 flacon de 250 ml,
Gram Iodine (stabilisé) : 1 flacon de 250 ml,
Gram Decolorizer : 1 flacon de 250 ml,
Gram Safranin : 1 flacon de 250 ml,

APPLICATION
Les trousses et réactifs Gram Stain sont utilisés pour colorer les microorganismes des cultures ou des échantillons par la méthode de Gram différentielle.

RESUME ET EXPLICATION
La coloration de Gram a été mise au point en 1884 par Christian Gram alors qu’il tentait de différentier les cellules bactériennes de tissus infectés. Bien qu’ayant observé ce qu’on appelle aujourd’hui la « réaction de Gram », Gram n’a pas reconnu la valeur taxonomique de sa technique.
La coloration de Gram est utilisée aujourd’hui pour différentier les bactéries intactes et morphologiquement similaires en deux groupes sur la base de la couleur des cellules après coloration. De plus, la forme, la taille et les détails structurels des cellules sont mis en évidence. Ces informations préliminaires fournissent des indices importants sur le type des organismes présents et sur les techniques plus approfondies requises pour les caractériser.
Comme la solution iodée inorganique s’oxyde rapidement et perd de son efficacité de mordant. Le "Gram Stain Kit" (réf.212539-BD/6334461-LF) diffère de la formule originale de Gram en proposant un complexe iodé organique plus stable : L-polyvinylpyrrolidone-iode.

PRINCIPES DE LA METHODE
La méthode de coloration de Gram comprend les étapes suivantes :
- Coloration d’un frottis fixé au cristal violet.
- Application d’une solution iodée servant de mordant.
- Décoloration du colorant primaire à l’alcool/acétone ; et contre-colorant à la safranine ou à la fuchsine basique.

Un complexe cristal violet-iode se forme dans le protoplaste (et non dans la paroi cellulaire) de tous les organismes marqués par cette méthode. Les organismes capables de conserver ce complexe de marquage après la décoloration sont classés Gram positifs tandis que ceux capables d’être décolorés et contre-colorés sont classés Gram négatifs.
Lors de la rupture ou du retrait de la paroi cellulaire, le protoplaste de cellules Gram positives (et Gram négatives) peut être décoloré et l’attribut Gram positif perdu. Ainsi, le mécanisme de la coloration de Gram apparaît lié à la présence d’une paroi cellulaire intacte afin de servir de barrière à la décoloration du colorant primaire.
En règle générale, la paroi cellulaire est non sélectivement perméable. Il est admis en théorie que pendant la méthode de coloration de Gram, la paroi cellulaire de cellules Gram positives est déshydratée par l’alcool présent dans le décolorant et perd de sa perméabilité, permettant ainsi de conserver le colorant primaire. Toutefois, la paroi cellulaire des cellules Gram négatives présente un contenu de lipides plus élevé et devient plus perméable une fois traitée à l’alcool, entraînant une perte du colorant primaire.
La base moléculaire pour la coloration de Gram n’a pas été encore déterminée.

PRELEVEMENT ET PREPARATION DES ECHANTILLONS
Appliquer l’échantillon de test à une lame de verre propre afin d’aboutir à un frottis uniforme finement étalé.
Emulsifier les colonies obtenues d’une culture de 18 à 24 h dans une solution saline pour obtenir la densité appropriée.
Laisser le frottis sécher à l’air.

Fixer le frottis sur la lame en utilisant l’une des techniques suivantes :
1. Fixer à la chaleur en passant la lame 2 à 3 fois à flamme faible. Laisser refroidir la lame à température ambiante avant la coloration. REMARQUE : Ne pas surchauffer la lame ; un chauffage excessif entraîne une coloration atypique.
2. Fixer la lame au méthanol en recouvrant au méthanol absolu pendant 1 à 2 min et rincer à l’eau courante avant La coloration.3 REMARQUE : Pour une fixation adéquate, conserver le méthanol absolu dans une bouteille brune à capuchon à vis et renouveler la solution d’analyse toutes les deux semaines.

METHODE
Préparation des réactifs :
Préparer la solution d’analyse iodée de Gram traditionnelle en ajoutant une ampoule complète de 2,5 mL de Gram
Iodine 100X à 250 mL de Gram Diluent, ou un flacon entier de 40 mL de Gram Iodine 100X à 3,8 L de Gram Diluent ; bien mélanger.
Matériaux fournis : Gram Crystal Violet, Stabilized Gram Iodine, Gram Decolorizer et Gram Safranin.
Matériaux requis mais non fournis : Lames de microscope, bec bunsen ou méthanol, ensemenceur bactériologique à anse, écouvillons, papier absorbant, microscope avec objectif à immersion dans l’huile et lame de Gram.

Mode opératoire du test :
1. Recouvrir le frottis fixé de colorant primaire (Gram Crystal Violet) et marquer pendant 1 min.
2. Retirer le colorant primaire en lavant délicatement à l’eau courante froide.
3. Recouvrir la lame de mordant (Stabilized Gram Iodine) et maintenir sur la lame pendant 1 min.
4. Retirer le colorant primaire en lavant délicatement à l’eau courante.
5. Décolorer (Gram Decolorizer) jusqu’à ce que le solvant coulant de la lame soit incolore (3 à 60 s).
6. Laver la lame délicatement à l’eau courante froide.
7. Recouvrir la lame de contre-colorant (Gram Safranin) et marquer pendant 30 à 60 s.
8. Laver la lame à l’eau courante froide.
9. Absorber avec des serviettes de papier absorbant ou laisser sécher à l’air libre.
10. Examiner le frottis sous l’objectif à immersion dans l’huile.

Contrôle de qualité par l’utilisateur :
Effectuer les contrôles de qualité conformément aux réglementations locales, nationales et/ou internationales en vigueur, aux exigences des organismes d'homologation concernés et aux procédures de contrôle de qualité en vigueur dans l'établissement. Il est recommandé à l'utilisateur de consulter les directives CLSI (anciennement NCCLS) et la réglementation CLIA correspondantes pour plus d'informations sur les modalités du contrôle de qualité.

LIMITATIONS DE LA METHODE
La coloration de Gram ne fournit que des informations d’identification préliminaires et ne remplace pas les études culturelles sur l’échantillon. Les résultats de coloration de Gram doivent être confirmés avec des méthodes supplémentaires, telles que des tests d’antigènes directs et la culture sur milieux.
Un traitement préalable avec des agents antimycobactériens peut faire apparaître des organismes Gram positifs comme étant Gram négatifs.
L’utilisation d’une culture de 18 à 24 h est conseillée pour obtenir de meilleurs résultats, car les cellules fraîches ont une plus grande affinité avec la plupart des colorants que les cellules anciennes. Ceci est particulièrement vrai pour de nombreux générateurs de spores, qui sont fortement Gram positifs lorsqu’ils sont observés dans les cultures fraîches, mais qui évoluent ensuite vers un état Gram variable ou Gram négatif.
La réaction de coloration de Gram est affectée par la rupture physique du protoplaste ou de la paroi cellulaire de la paroi bactérienne. Les parois cellulaires de bactéries Gram positives s’interposent en barrière pour empêcher le complexe colorant d’être lessivé du cytoplasme. Les parois cellulaires des bactéries Gram négatives contiennent des solubles lipides dans des solvants organiques, qui sont ensuite libres de décolorer le cytoplasme. Un microorganisme qui est physiquement rompu par une chaleur excessive ne réagit donc pas à la coloration de Gram comme prévu. « Un respect méticuleux de la méthode et des critères d’interprétation est nécessaire pour obtenir des résultats précis. La précision est fortement tributaire du niveau de formation et de compétence du microbiologiste. »²
Les résultats de coloration de Gram, y compris la morphologie des organismes, peuvent être affectés par l’âge de l’isolat, par la bactérie contenant les enzymes endocellulaires qui produisent l’autolyse, par les cultures transférées du milieu contenant l’antibiotique, et par les échantillons prélevés auprès des patients sur les antibiotiques.⁴ «Les artéfacts et les matières en arrière-plan peuvent également gêner l’interprétation. Une coloration de Gram positive avec précipité présente généralement des formes cocciformes irrégulières ou des asters ressemblant à des hyphes fongiques. »⁴

RESULTATS ATTENDUS ET CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCES ^1-4
Réaction avec Safranine de Gram :
-    Gram positif => Cellules violet noir,
-    Gram négatif => Cellules rose à rouge.